Summary I Aims I Methods

 가. 과학기술적 측면에서의 문제제기

1) 생체내 아연의 일반적 역할

아연 (zinc)은 모든 살아 있는 세포의 정상적인 기능에 필수 불가결한 금속이다 (Vallee, 1959). 예를 들면, carbonic anh ydrase (Vallee, 1959), metalloprotease (Hooper, 1994), 그리고 protein kinase C (Ono et al., 1989) 를 포함하는 수 백 종류 의 세포내 효소 (enzyme)들이 아연을 필요로 한다. 더욱이 아연은 zinc-finger motif를 가지는 많은 종류의 전사 인자 (transcr iption factor)들이 DNA에 결합하는 구조를 이루는 데 필수적인 금속이고 (Pan and Coleman, 1989), 따라서 세포내의 유전자 조 절에 아주 중요한 역할을 수행하고 있다. 이러한 세포 내에서의 중요 역할들을 고려하건대, 모든 세포가 생존을 위해 적절한 양 의 아연을 필요로 한다는 것은 그리 놀라운 사실은 아니다.

2) 중추 신경계의 시냅스 아연

중추신경계도 예외가 아니어서, 특히 대뇌와 선체 (corpus striatum) 등의 신경세포들이 많이 모여 있는 부위에는 상당한 양의 아연이 존재한다. 이 중 상당량의 아연이 glutamatergic neuron의 신경 말단에 비교적 자유로운 형태로 다른 신경전달 물 질들과 마찬가지로 시냅스 소포체 (synaptic vesicle) 안에 존재한다. 이러한 시냅스 아연은 간단한 조직화학 염색방법들로 쉽 게 동정할 수 있다 (Dansher et al., 1985; Frederickson et al., 1983; Frederickson et al., 1987). Glutamate 신경 말단에서 의 시냅스 아연의 농도는 1 mM 이상으로 추정되고 있고, 특히 vesicle 안에서의 아연 농도는 이 보다 더 높을 것으로 (>10 mM ) 예상된다 (Frederickson, 1989).

3) 시냅스 아연의 전기생리적 역할

시냅스 아연의 생리적 역할에 대해서는 몇 가지 가설이 존재하여 왔다. 첫째 가설은 아연이 신경 전달 물질, 특히 glutam ate를 소포체 안에서 안정화시키는 역할을 한다는 것이다. 둘째, 아연이 신경전달 물질 (neurotransmitter)의 생성과 축적 등에 관계되는 효소들의 조인자로 작용한다는 가설이다. 셋째 가설은 시냅스 아연이 신경세포간의 신호 전달, 특히 같은 신경 말단에 공존하는 신호전달 물질인 glutamate에 의한 흥분성 신호 전달에 직접 영향을 미치리라는 것이다. 이 마지막 가 설은 다음에 소개하는 연구 결과들에 의해 가능성이 아주 큰 것으로 밝혀졌다.
우선, 시냅스 아연이 다른 신경전달 물질과 마찬가지로 신경의 흥분에 따른 신경 말단으로의 칼슘의 유입에 의하여, 시 냅스 간극 (synaptic cleft)으로 방출된다는 것을 보고하였다 (Assaf and Chung, 1984; Howell et al., 1984). 이러한 결과들에 이어, 본 저자 등과 Westbrook, Mayer 등은, 아연이 glutamate 수용체 중에서 NMDA 수용체에 의해 매개되는 양이온의 유입을 강 력하게 차단하는 현상을 발견하여 각각 Science와 Nature에 보고하였다 (Peters, Koh, Choi, 1987; Westbrook and Mayer, 1987).

4) 아연에 의한 신경세포사: 신경계 질환에서의 역할

생리적 작용 외에, 중추신경계의 병리적 현상들에 있어서도 시냅스 아연이 중요한 역할을 할 가능성이 여러 연구 결과들에 의 해 제시되었다. 우선 대뇌피질 신경세포 배양체를 과다한 아연에 노출시키면, 짧은 시간 안에 광범위한 신경세포 사멸을 유발하 게 된다 (Yokoyama, Koh, Choi, 1986). 이러한 아연의 농도는 실제 동물의 뇌에서, 경련이나 허혈의 경우에서 방출되는 아연의 세포외액에서의 농도와 거의 비슷한 수준이고 (Howell et al., 1984), 따라서 아연의 방출이 신경세포사를 일으킬 개연성이 상 당히 크다. 아연에 의해 매개되는 신경세포사는 칼슘 이온 통로를 통하여 아연이 과다하게 신경 세포 내로 유입됨으로써 일어나 게 된다 (Koh and Choi, 1994; Weiss et al., 1993).
아연에 의한 신경세포사가 실제 동물에서의 여러 병리적 상황에서도 중요한 기전으로 작용하리라는 가설에 부합되게, 최근에 본 저자 등은 흰쥐에서 일과성 전뇌 허혈 (transient global cerebral ischemia) 시 일어나는 선택적 신경세포사가 주로 시냅스 아연의 시냅스 후 신경 세포 내로의 전이 (translocation)에 의해 초래된다는 것을 밝혀 Science 지에 보고하였다 (Koh et al. , 1996). 일과성 전뇌 허혈의 경우 외에도 간질과 국소적 허혈 등의 여러 급성 신경세포사가 초래되는 경우들에서 아연의 전이 에 의한 신경 독성이 그 중심적 기전으로 작용할 가능성이 크다 (Koh, unpublished).

5) 새로운 신호 전달 물질로서의 시냅스 아연

지금까지 언급한 아연에 의한 신경세포사는 방출된 아연이 칼슘 이온 통로를 통하여 신경세포 안으로 과다하게 유입됨으로써 일어난다. 이러한 아연의 유입이 정상시 적당한 정도로 일어나는 경우에는 중요한 신호 전달에 관계된 생리적 기능을 수행할 가 능성이 크다. 아연의 경우와 비슷한 예가 흥분성 신경 전달 물질인 glutamate 이다. Glutamate의 경우도 신경 말단의 소포체에 있다가 병리적 상황에서 세포 외로 방출되고, 그 결과 NMDA 수용체를 통한 과다한 칼슘 유입을 유발하여 신경세포사를 일으키게 되는 것으로 알려져 있다 (Choi, 1988). NMDA 수용체는 생리적인 상태에서는 자극된 신경세포에 적절한 정도의 칼슘 유입을 일으 켜, long-term potentiation (LTP)과 같은 신경간 신호 전달에 중요한 변화를 초래하는 것으로 알려져 있다 (Collingridge et al ., 1983). 아연의 경우도 칼슘의 경우와 마찬가지로 생각된다. 하지만 칼슘의 경우와는 달리 아직 정상 상태에서의 아연의 유입 이 신경세포에 구체적으로 어떤 작용을 하는 지는 알려져 있지 않다.
지난 20 여년 간의 신경과학 분야를 돌이켜 보면, 신경세포에서 일어나는 여러 중요 현상들을 일으키는 데 관여하는 주 이차 신호전달 물질 (second messenger)은 칼슘이라고 알려져 왔다. 칼슘의 유입에 의해 활성화되는 효소 중 대표적인 것들이 protei n kinase C (PKC) 와 calcium/calmodulin-dependent kinases (CaM kinases), 그리고 calcium activated protease (calpain) 등 이다. 이들 칼슘의존성 효소들은 특히 기억 현상의 생물학적 기전으로 알려진 해마에서의 long-term potentiation (LTP)의 생 성 유지에 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다 (Linden and Routtenberg, 1989; Malenka et al., 1989). 따라서, 칼슘의 유 입은 LTP를 포함한 여러 중요 신경생물학적 현상들의 방아쇠 역할을 하는 것으로 여겨져 왔다.
하지만 곰곰이 생각해보면, 칼슘 이온은 모든 세포외액에 고르게 존재하고 다양한 자극에 의해 열리는 여러 칼슘 통로를 통하 여 세포 안으로 유입되므로, 시냅스에 한정적인 특수 현상의 단일 매개체로는 이상적인 물질이 아니다. 이에 반하여, 시냅스 아연은 주로 LTP를 유발시키는 고빈도 자극에 의해서만 그 시냅스에서 시냅스 간극으로 방출되고 (Howell et al., 1984), 또 그 시냅스 주위에서 glutamate에 의해 열리는 이온 통로만을 통하여 유입되므로, 시냅스에 아주 한정적인 변화를 일으킬 수 있다. 따라서, 시냅스 아연의 경우가 칼슘의 경우보다 LTP 형성의 시냅스 한정성을 더 잘 설명할 수 있다.
더우기, 아연은 protein kinase C (PKC)와 CaM kinase II의 활성도에 칼슘과 더불어, 또는 단독으로 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다 (Csermely et al., 1988; Weinberger and Rostas, 1991). 이러한 증거들에 바탕을 두고, 본 저자는 시냅스 아연이 LTP 와 같은 중추신경계에서의 신호 전달 과정에 아주 중요한 작용을 할 것이라는 새로운 가능성을 제안한다.
아연은 또한 immediate early gene을 포함하는 유전자 전사 인자 (transcription factor)들을 활성화시키는 것으로도 알려져 있다. 이러한 전사 인자들은 공통적으로 2 His-2 Cys 로 구성된 zinc-finger motif (Pan and Coleman, 1989)를 가지고 있는 단백질들로서, 여러 가지 신호 전달의 초기 과정에 관여하는 물질들이다. 또한 이러한 전사 인자들 중 일부는 직접적으로 아연의 세포 내 유입에 의해 유도된다 (Sharp and Sagar, 1994). 뿐만 아니라, 아연의 유입은 신경세포 손상시 증가되는 heat shock pr otein (HSP)의 발현을 유도하고 (Sharp and Sagar, 1994), HSP에 의해 조절되는 여러 유전자 발현에 변화를 일으킨다. 이러한 과정들은 신경 세포 손상시 뿐 아니라, 정상적인 신호 전달에 아주 중요한 과정들로 여겨지고 있다. 이 모든 실험 증거들을 고려하면, 시냅스 아연이 아주 새로운 형태의 신호 전달 물질로 작용할 가능성이 큰 것으로 여겨진다. 다시 말하면 신경세포 말단의 소포체에 존재하다가 고빈도의 자극과 함께 세포 밖으로 방출되어 (
first messenger), 시냅스 후 세포 안으로 들어가 아연 자체가 여러 가지 중요한 신호 전달 작용을 직접 매개하는 (second messenger), 지금까지 그 유래가 없었던 새로운 형태의, first 와 second messenger 의 역할을 동시에 하는, "orthograde trans-synaptic messenger" 일 가능성이 아주 크다.

6)시냅스 아연과 신경퇴행성 질환들

아연의 병리적 작용의 가능성 중 흥미로운 것은 만성 신경퇴행성 질환들 - 예를 들어 노인성 치매 (Alzheimer's d isease)-에서 시냅스 아연의 역할이다. 최근 아연이 낮은 농도에서 amyloid protein 의 응집을 항진시킨다는 보고가 있었다 (Bush et al., 1994). amyloid 의 응집은 신경세포 사멸과 밀접한 관계가 있는 것이 알려져 있다 (Pike et al., 1993). 아 연의 병인적 역할을 시사하는 다른 간접 증거는 amyloid plaque 들의 분포와 시냅스 아연의 분포가 아주 잘 일치한다는 사실이 다. 예를 들어 hippocampus, entorhinal cortex, 그리고 neocortex 의 layers II, III, V, basal forebrain등은 모두 시냅스 아연이 풍부하게 분포하는 곳이다 (Frederickson, 1989; Perez-Clausell et al., 1985). 이에 반해 노인성 치매에서 신경세포 의 소실이 잘 일어나지 않는 소뇌에서는 amyloid 의 광범위한 침착 (diffuse deposit)은 관찰되지만, amyloid plaque 의 형성 은 아주 드문 것으로 알려져 있는데, 흥미롭게도 소뇌에는 시냅스 아연이 거의 없는 것으로 알려져 있다 (Frederickson, 1989).
또한 노인성 치매의 또하나의 중요 병리적 변화인 neurofibrillary tangle의 형성에도 시냅스 아연이 기여할 가능성이 있는 것으로 여겨진다. 우선, neurofibrillary degeneration의 분포와 시냅스 아연의 분포가 역시 잘 일치하는 것으로 보인다. 또한 neurofibrillary degeneration은 cytoskeletal protein 의 일종인 tau가 비정상적으로 인산화되어 신경세포 내에 축적되는 현상인 데, 아연과 같은 heavy metal들은 이러한 cytoskeletal protein들에 변성을 일으킨다는 것이 알려져 있다 (Fennell and Sosl au, 1992; Forbes et al., 1990; Kress et al., 1981). 하지만 아연의 유입이 정확히 tau protein 자체에 어떤 변화를 일으키는 지는 아직 연구된 바가 없다.

7) 결론: 시냅스 아연 연구의 적시성

지금까지 언급한 여러 가지의 아주 흥미로운 가능성들에도 불구하고, 아연의 생리적, 병리적 작용과 그 기전에 대한 연 구는 아직 아주 초기 단계라고 할 수 밖에 없는 실정이다. 하지만 이 분야는 앞으로 무궁 무진한 전개의 가능성을 내포하고 있 어, 향후 2 - 3 년 안에 이에 대한 신경과학자들의 관심이 폭발적으로 증가하기 시작할 것으로 예측된다. 따라서, 바로 지금이 이 방면의 연구를 시작하는 데 가장 적절한 시기로 사료되고, 이 시기를 놓치지 않고 전력 투구하여 연구해 나간다면, 앞으로 이 분야에서 우리가 세계의 다른 어떤 연구진보다 선도적인 역할을 할 수 있으리라 생각된다.
 

나. 사회경제적 측면에서의 문제제기

시냅스 아연의 작용들에 대한 연구에 관하여 사회경제적 측면에서의 문제 제기는 크게 두 가지로 나누어 볼 수 있다.
1) 전 세계적으로 인구의 노령화와 더불어 노인성 신경과적 질환들의 유병율이 높아지고 있고 이에 따라 이러한 질환의 치료법과 예방법을 개발하는 것이 사회 경제적으로 시급한 과제라는 점이다. 예를 들어 뇌경색과 뇌출혈을 포함하는 뇌졸중 (stroke) 은 구미에서는 암과 심장질환에 이어 3위의 사망원인이고, 우리나라에서는 악성 종양에 이어 2위의 사망원인으로 보고되어 있다. 또한 노인성 치매 (Alzheimer's disease) 는 구미에서 뇌졸중에 이은 4위의 사망원인으로 보고되어 있다. 이 두 질환만을 고려하더라도, 그 사회경제적 부담은, 금액으로 환산할 때, 가히 천문학적 숫자에 이른다고 하겠다. 또한, 이러한 질환들은 계산상 나타나는 막대한 금전적 손실이외에 계산되어 질 수 없는 커다란 인간적, 사회적 부담을 야기하게 된다. 이러 한 사회경제적인 이유로 인하여, 여러 나라에서 뇌졸중과 노인성 치매를 포함한 신경퇴행성 질환들에 대한 연구가 최근 들어 급 속도로 진행되어 가고 있다. 여러 신경퇴행성 질환들의 공통점은 그 병리 현상의 근저에 신경세포의 사멸이 자리잡고 있다는 사 실이다. 따라서, 신경세포사의 기전을 이해하는 것이 이러한 질환들의 치료에 결정적인 기여를 할 것으로 여겨진다.
지금까지 알려져 있는 신경세포사의 주 기전은 크게 3 가지로 요약될 수 있다. 첫째는 흥분성 신경 전달 물질인 glutamate의 과다 방출과 그에 따른 glutamate 수용체의 지속적인 활성화, 칼슘 유입에 따른 excitotoxicity에 의한 신경세포사다. 둘째는, 특히 허혈 후 재관류시에 일어나는 현상으로 유리 산소기 (oxygen free radical)의 과다 생성에 의한 세포 산화 손상이다. 마지 막으로는 최근 연구 주제로 각광을 받고 있는 programmed cell death 또는 apoptosis라고 불리는 기전이다. 이 중 excitotoxicty 가 현재 가장 많이 연구되어 있고, 이것을 방지하기 위한 방법들이 가장 잘 알려져 있다. 여러 가지 anti-excitotoxic drug들 을 개발하기 위하여서만, 지금까지 수 십 억불의 연구비가 투자되었는데, 이러한 막대한 투자는 물론, 엄청난 잠재 시장 규모와 그에 따른 막대한 상업적 기대치 때문이다.
최근 본 저자등은 일과성 전뇌허혈 후에 일어나는 선택적 신경세포사의 경우에, 칼슘에 의한 excitotoxicity 보다는, 시냅스 아연의 전이가 그 주원인이라는 것을 밝혔고, 아연을 chelate 하는 방법이 지속적인 신경세포 보호 작용을 나타낸다는 것을 보여 주었다 (Koh et al., 1996). 따라서, 이 경우에는 이러한 방법의 응용이 anti-excitotoxic 접근법보다 더욱 효과적일 것으로 여 겨진다. 본 저자의 의견으로는 시냅스 아연에 의한 신경세포사가 excitotoxicity, free radical injury, 그리고 apoptosis와 함 께 여러 신경 질환에서의 신경세포사의 주 기전으로 작용할 것으로 추정한다. 따라서, 우리가 초기에 이 연구에 참여하게 되면 이 분야를 지속적으로 선도해 나가고 나아가 신약 개발을 먼저 이룩할 가능성이 클 것으로 기대된다. 덧붙여, 만성 신경퇴행성 질환들에 있어 시냅스 아연의 역할 규명 - 예를 들어 노인성 치매에서의 베타 아밀로이드의 응집 - 은 좀 더 광범위한 분야에서 의 신약 개발과 예방법 등에 응용될 수 있을 것이다.
2) 신경과학계를 포함한 우리나라 과학계에서 아직까지 세계에서 처음으로 개척하고 진행시키는 주 연구 분야가 거의 없었다는 사실이다.
지금까지의 우리 나라의 과학 연구는 선진국에서 이미 상당히 진행되고 있는 분야를 배워 와서 그것을 모방, 응용하는 수준이 었다. 이러한 현실은 연구 인구의 저변 확대, 연구 기술의 축적 등의 많은 긍정적 효과를 가지고 왔지만, 아직 세계를 선도할 만한 연구를 이루어 내지 못하는 주 요인인 것도 사실이다. 본 저자는 감히 이번 연구가 이러한 타성을 극복하고 우리 나라에서 처음으로 신경과학 분야의 신영역을 개척하는 첫 시도가 될 수 있으리라고 자신한다. 추측대로 시냅스 아연이 기억 등의 기전 으로 생각되는 long-term potentiation (LTP) 등의 synaptic plasticity의 생성 유지에 기여한다면, 이러한 정보는 현재까지 논 의되지 않은, 새로운 신경 과학 원리의 시발점이 될 것이다. 또한 이러한 기전을 연구하는 것은 인간의 본질인 고등 인지능력의 형성과 작동 과정에 대한 이해를 증진시키는 시금석이 될 수 있을 것이다. 이러한 본 연구의 커다란 잠재 가능성이 창의적 연 구 진흥 사업의 취지에 잘 부합된다고 생각된다.
 

다. 국내외 연구동향

우선, 국내에서 중추 신경계 시냅스 아연의 역할에 대한 연구를 하는 그룹은 본 연구팀을 제외하고는 없다. 전 세계적으로도 시냅스 아연의 역할에 대한 본격적인 연구는 이제 막 시작된 단계라고 할 수 있고, 현재 이에 대한 연구를 지속적으로 진행하고 있는 것으로 알려진 그룹은 통틀어 열 손가락으로 꼽을 수 있을 정도이다. 다음은 신경계 아연에 관한 연구를 정리한 후, 현재 연구되고 있는 과제들을 요약하여 본 연구 과제와의 차이점을 비교한 것이다.

1) 시냅스 아연 연구의 태동

1960-80 연대 초까지는 주로 아연의 중추 신경계에서의 조직-해부학적인 분포도 등에 대한 연구가 주를 이루었다. 이러한 기초 연구들에 의하여 중추신경계내의 일부 glutamate 신경세포 말단의 소포체 (vesicle) 안에 상당량의 아연이 단백질과 결합 되지 않은 형태로 존재한다는 것이 밝혀졌다 (Frederickson et al, 1983). 이 후 1984년도에 시냅스 아연이 다른 신경전달물질과 마찬가지로 여러 가지의 생리적 자극에 의해 시냅스 간극으로 방출된다는 것이 발견되었다 (Assaf and Chung, 1984; Howell et al., 1984). 이러한 결과들은 아연이 glutamate에 의한 신호 전달에 관여하리라는 가능성을 간접적으로 제시해 주었으나, 직접 적인 증거는 1987년도에 이르러서야, 본 저자 등과 Westbrook, Mayer 가 처음으로 M 농도의 아연이 glutamate 수용체의 작용에 큰 영향을 끼친다는 것을 발견함으로써 얻어지게 되었다 (Peters, Koh, Choi, 1987; Westbrook and Mayer, 1987).

2) 배양체에서의 아연에 의한 신경세포사 발견과 그 기전 연구

80연대 후반에 본 저자와 동료들은 아연에 의한 신경세포사를 흰쥐의 대뇌 신경세포 배양체에서 연구하기 시작하였다 (Yok oyama, Koh, Choi, 1986; Choi, Yokoyama, Koh, 1988). 이 후 90 연대 초에 와서 본 저자 등은 아연의 신경 독성 기전이 신경 세포 내로 유입에 이어 일어난다는 것을 알아내었다 (Weiss et al., 1993; Koh and Choi, 1994).
아연이 신경세포 내로 유입된다면 그 경로는 무엇인가? 아연은 NMDA channel을 그 안에서 차단하며, 이러한 작용은 아연이 NMD A channel을 통과할 가능성을 강력히 시사한다. 왜냐하면, NMDA channel 의 open channel blocker 로 잘 알려진 magnesium 도 어느 정도 NMDA channel 을 투과하는 것으로 알려져 있고, NMDA 투과성이 높은 것으로 알려진 칼슘도 실제로는 NMDA channel을 통한 Na 이온의 통과를 open channel block 형식으로 차단하는 특성을 가지고 있다 (Mayer and Westbrook, 1987). 따라서 칼슘, 아연, 마그네슘들이 모두 NMDA 수용체의 open channel blocker 이며 permeator 이다. 실제로, 아연 유입과 그에 따른 신경세포 사는 NMDA channel 을 그 길항제로 차단할 경우 상당히 감소한다 (Koh and Choi, 1994).
NMDA 수용체이외에, 아연이 voltage-gated calcium channel 을 통하여 신경세포 안으로 들어갈 수도 있다는 것을 Weiss 그리고 본 저자 등이 발견하여 보고하였다 (Weiss et al, 1993). 이 후 Weiss 등은 AMPA/kainate 수용체중 칼슘 투과성이 높은, "
GluR2 subunit이 없는 수용체 (Glu-R2-less AMPA/kainate receptors)" 도 아연을 통과시킨다는 것을 보고하여 , 여러 종류의 칼슘에 대한 투과성이 높은 이온 통로들이 아연의 신경세포 내로의 유입 통로로 사용될 수 있다는 것이 알려지게 되었다.

3) 아연이 새로운 신호 전달 물질로서 작용할 가능성 시사

이러한 아연의 신경세포 내로의 유입이 정상시에 어떤 생리적 기능을 수행하는 지에 대한 연구는 아직 전혀 되어있지 못하다. 본 연구의 주 아이디어도 이러한 아연의 전이가 신경세포간의 신호 전달, synaptic plasticity, 유전자 조절 등에 미치는 영향을 체계적으로 연구하는 것이다. 이러한 가능성을 지지하는 한 예로 중추신경계의 발달 과정 중에 일어나는 시냅스 아연과 NMDA 수용체의 변화 과정을 살펴 보면, 둘 간에 아주 긴밀한 관계가 있는 것을 알 수 있다 (Koh, unpublished). 아직 어린 신경세포 에서는 NMDA 수용체 subunit 중에서 NR-1/NR2B 로 이루어진 수용체가 주를 이루고 아연의 NMDA 수용체에 대한 작용도 voltage-in dependent block 이 주 기전이다가, 신경 세포가 좀 더 성숙하게 되면 NMDA 수용체의 구성이 NR-1/NR-2A 로 바뀌면서 아연의 작 용도 voltage-dependent block 이 주가 되게 된다 (Williams et al, 1993; Wenzel et al, 1997). 즉 위에 언급한 아연의 NMDA수용체에 대한 open channel block /permeation 의 현상 (Mayer and Westbrook, 1987) 이 신경세포의 성숙과 함께 발달한다는 것이 다. 이러한 과정은 글루타메이트 신경세포의 말단에서 시냅스 아연이 점차 발달하는 시간 과정과 정확히 일치한다 (Suh and Koh , unpublished). 따라서 신경세포의 성숙과 함께 시냅스를 가로지르는 (trans-synaptic) 신호 전달물질로서의 시냅스 아연 의 역할이 시작되는 것으로 보여진다.

4) 여러 병리적 상황에서의 시냅스 아연에 의한 신경세포사의 역할 연구

아연에 의한 신경세포사가 세포 배양 체계에서는 의심의 여지없이 일어나나, 실제로 실험 동물에서의 병리적 상황들에서 신경세포사를 일으키는 지에 대한 직접적인 증거들은 최근까지 존재하지 않았다. 저자는 최근 아연에 의한 신경 독성이 실제 뇌 허혈과 같은 병리 상황에서 일어나는 신경세포사의 주 기전일 것이라는 가설을 제창하였고, 이러한 아이디어를 직접 동물 전뇌 허혈 model 에서 검증하여, 96 연도 Science 지에 그 결과를 발표하였다 (Koh et al, 1996). 현재 animal model에서 아연에 의 한 신경세포사를 연구하는 그룹은 거의 없고, UT Dallas의 Fredercikson group 이 trauma model에서 아연의 역할을 주로 해부학 적 방법으로 연구하고 있는 것으로 알고 있다 (personal communication).

5) 현재 시냅스 아연을 연구하는 그룹들

현 시점의 연구 상태를 정리하면, 뇌내 아연의 병리-생리적 작용에 대한 연구는 아주 소수의 연구 team에 의해 단편적으로 수행되고 있다고 할 수 있겠다. 이 중 배양 신경세포에서 excitotoxicity를 주로 연구하는 Washington University의 Dennis W. Choi group은 세포 배양체에서 아연 신경 독성과 그 기전에 대해 연구하고 있고, 이 외에 생리적인 수준의 세포내 유리 아연 의 농도 측정법을 개발하고 있다 (personal communication). UC Irvine의 Weiss group은 소규모로 배양체에서 아연에 의한 신경 세포사를 연구하고 있으나 본 연구자와의 1993 연도 협동 연구 (Weiss et al., 1993) 이후에는 이렇다할 만한 새로운 발견은 하 지 못 하고 있다. 최근, 아연을 binding하는 metallothionein (MT) 중 중추 신경세포에 존재하는 MT-III의 유전자를 제거한 (kno ck-out) 흰 쥐에서, kainate seizure 후의 hippocampal neuronal death가 증가하는 현상이 University of Washington 의 Palmite r group에 의해 보고되어, kainate seizure에서의 신경세포사도 시냅스 아연이 중요한 기여를 한다는 것이 강력히 시사되었다 (E rickson et al, 1997). 이 외에 노인성치매의 분자생물학적 병인을 연구하는 Tanzi group이, 아연이 노인성 치매에서의 베타 아 밀로이드의 응집, 축적에 기여할 가능성이 있다는 것을 발견, 보고하였다 (Bush et al, 1995). 초기부터 시냅스 아연의 존재 를 발견하고 해부-생리적으로 연구해 온 Frederickson group 은 현재 본 저자와 공동으로 생체 내에서 아연의 방출을 직접적으로 monitor 할 수 있는 방법 (enzyme-linked zinc probe, "EnZinc" probe) 을 개발하고 있다. 또 다른 초기 시냅스 아 연 연구자 중 한 사람인 Denmark 의 Dansher 는 기존의 아연 동정법을 이용하여 허혈 등의 병리 상황에서의 시냅스 아연의 변화 를 연구하고 있다. 이렇게 살펴보면, 시냅스 아연에 대한 연구가 여러 방면에서 단편적으로 이루어지고는 있으나, 이런 종류의 연구들은 그 각각으로는 아연의 종합적 역할에 대한 이해를 도출하기에는 무척 미흡하다고 여겨진다.

6) 결론

결론적으로 현재까지의 이 분야의 국내외 연구는 아직 태동 단계라고 할 수 있고, 전세계적으로 살펴보더라도, 본 연구 제 안에서와 같이 시냅스 아연의 역할 규명에 대한 종합적인 시도를 하는 곳은 없는 것 같다. 현재, 본 연구 과제와 연계되어 있는 LTP 라든지 신경세포사의 기전 연구 같은 신경과학의 주 분야들은 이미 전세계적으로 여러 유명연구 팀들이 다각도로 활발히 연 구를 진행시키고 있다. 하지만 이러한 연구들이 대부분 기존의 사고 - 예를 들어 calcium, glutamate, NO, free radical, programmed cell death, kinases - 안에서 연구를 진행하고 있고 이미 각 방면에 상당히 연구가 진척되어 있어, 현재는 아주 새로운 breakthrough 보다는 기존의 이해에 점진적인 증가를 더하는, 일종의 steady-state에 접어든 느낌이다. 하지만, 희망한대로 시냅스 아연이 이러한 다양한 현상의 기전을 좀 더 종합적으로 설명할 수 있는 새로운 틀을 제공하게 되고, 그에 따라 이 분야들의 현상들을 이해하는 데에 근본적인 paradigm shift가 일어난다면, 많은 신경과학 연구진들이 곧 이 시냅스 아연의 연구에 참여하게 될 것으로 예상된다.
 

3. 연구가설 또는 핵심 아이디어

위에 언급된 시냅스 아연의 가능한 생리-병리적 작용들을 종합적으로 연구하기 위하여 본 연구에서는 세 줄기의 큰 연구 가설 을 세우고 이에 대한 검증을 시도할 예정이다. 이 세 가설은 다음과 같다.
I. Glutamate 신경세포 말단에 있는 시냅스 아연이 고빈도 자극에 의해 방출되고, 칼슘을 통과시키는 이온통로가 열림에 따라 이를 통해 신경세포 안으로 유입됨으로써, 시냅스를 가로지르는 새 형태의 신호전달물질 (orthograde trans-synaptic messenger)의 역할을 한다.
II. 아연의 방출과 유입이 과다하게 일어나는 병리적 상태에서는 아연의 유입에 의해 신경세포사가 초래된다.
III. 아연의 방출이 노인성 치매 (Alzhiemer's disease; AD)에서 beta amyloid 의 응집, tangle formation, 그리고 신경 세포사에 기여한다.
이러한 세 주 가설들을 구체적으로 지지할 수 있는 각각의 세부 가설들과 그 논리적 배경, 그리고 검증 방법 등은 다음과 같다.
 

세부 가설 I-1
시냅스 아연의 유입이 LTP를 비롯한 여러 synaptic plasticity에 중요한 역할을 한다.

척추 동물의 기억 현상을 설명하는 기전으로 가장 가능성이 큰 것이 long-term potentiation (LTP)이라는 현상이다. 지금 까지는 이러한 LTP의 생성에 칼슘의 유입이 필수적인 과정으로 알려져 왔다. 칼슘의 유입은 PKC 나 CaM kinase II 같은 신호 전 달과 관계된 인산화 효소와 nitric oxide synthetase (NOS)를 활성화하여, 시냅스전과 시냅스후 구조 양쪽에 유전자 활성화를 수 반하는 지속적인 변화를 일으켜 시냅스 반응을 증가시키는 것으로 이해되고 있다.
하지만 칼슘 유입만으로는 LTP의 시냅스 한정성을 설명하기에 미흡하다. 왜냐하면, 칼슘은 세포외액에 골고루 존재하고, 여러 칼슘 통과 통로가 다양한 자극에 의해 빈번하게 열리므로, 각 시냅스 부위에서의 칼슘의 유입은 고빈도의 자극이 없더라도 이론 적으로 상당히 빈번하게 일어날 수 있어, 원치 않은 경우에도 LTP가 일어날 가능성이 있기 ㄸ문이다. 이러한 칼슘가설을 반박하 는 또 하나의 증거는, 시냅스후 신경세포에 칼슘 유입을 일으키는 NMDA 수용체의 자극만으로는 LTP가 생기지 않고, 다른 presyna ptic factor 가 같이 있어야 LTP가 일어난다는 사실이다 (Kauer et al, 1988). 본 저자 등은 Nature에 이 presynaptic factor  시냅스 아연일 가능성을 기고하였다 (Weiss et al, 1989.).
이 가설을 검증하기 위하여 해마 CA1과 CA3에서의 LTP model에서 아연의 방출이 일어나는 지를 측정하고, 아연이 시냅스 후 세포로 전이되는 지를 보기 위해 TSQ 방법 (Frederickson et al, 1987) 등을 이용하여 측정한다. 또한 이러한 아연의 유입을 선 택적인 chelator를 이용하여 차단할 경우 LTP에 어떤 영향을 미치는 지를 관찰한다. 이러한 실험들에서 긍정적인 결과가 얻어 지면, 다른 부위에서의 LTP 에서도 같은 원리가 작용하는 지를 살펴본다.
 

세부 가설 I-2
신경간 신호 전달 시 일어나는 immediate early gene 등의 전사 인자 발현에 중요한 역할을 한다.

중추신경계에서는 아연이 신경 세포의 활동에 따라 시냅스를 가로질러 이동하게 되므로, 이 경우 아연의 유입에 의해 zinc finger를 가지는 여러 전사인자들이 유도, 활성화되는 지의 여부가 흥미로울 것이다. 실제로 배양신경세포체에서는 아연에의 노출이 IEG인 c-fos 를 활성화시키는 것이 알려져 있다 (Sharp and Sagar, 1994; Koh, unpublished). 현재 많은 연구자들이 c- fos의 활성화를 일으키는 물질로 칼슘에 주목하고 있으나, 아연도 여기에 관여할 가능성이 큰 이온이다. 따라서, 위에 언급한 방식을 사용하여, LTP, 경련, 허혈 등에서의 IEG들의 활성화와 아연의 전이가 어떤 관련이 있는 지를 규명할 수 있을 것으로 기대된다.
 

세부 가설 I-3
신경 활동에 의해 유발되는 neurotrophin gene 의 induction을 매개한다.

Neurotrophin 은 NGF 로 대표되는 일군의 neurotrophic factor들을 일컫는다. 이들은 tyrosine kinase activity를 가지는 수용체에 결합하여, 해당 신경세포의 neurite outgrowth, cell body hypertrophy, 그리고 cell survival 등을 항진시킨다. 흥미롭게도 경련이나 허혈 시, neurotrophin 유전자의 활성화가 일어나는 것이 보고되어 있다 (Gall and Isackson, 1989; Isackson et al, 1991; Kokaia et al, 1995). 이 경우 어떤 신호전달 과정이 관여하는지는 알려져 있지 않으나, LTP의 경우와 마찬가지 로 칼슘 이온의 유입이 중요한 과정으로 여겨지고 있다. 하지만, 이들 부위 역시 시냅스 아연이 상당량 존재하는 곳이고 따라서 , 칼슘과 더불어 아연의 방출과 유입이 neurotrophin 유전자 활성화의 한 기전일 가능성이 존재한다.
In situ hybridization, immunocytochemistry, western blot 등을 이용하여, 아연의 유입에 의해 neurotrophin mRNA와 protein이 유발되는지 세포배양체를 이용하여 검증하고, 경련이나 허혈의 동물 model에서 아연의 chelation이 neurotrophin gene induction을 방지하는 지 검증할 예정이다.
 

세부 가설 II-1
여러 종류의 병리적 상황들 - 허혈이나 경련 - 에서 heat shock protein (HSP)의 induction을 매개한다.

Heat shock protein (HSP)은 다양한 세포에서 여러 종류의 스트레스 후 유발되는 단백질이다. 중추 신경계에서도 경련이 나 허혈 후에 특정 신경세포 군에서 HSP가 발현되는 것이 보고되어 있다 (Chopp et al, 1991). 스트레스 후 HSP의 유발이 어떤 기능을 수행하는가는 아직 논란이 있다. 일부 연구에서는 스트레스 후 HSP 유발이 세포 방어적 기능을 한다고 주장되고 있으나 (Kitakawa et al, 1991), 다른 연구에서는 HSP를 발현하는 신경 세포들은 이미 비가역적인 손상을 받아 죽어 가는 세포라고 발 표되어 있다 (Yee et al., 1993). 어쨌든, HSP의 유발이 경련이나 허혈 후에 일어나는 것은 많은 연구 결과들에 의해 확실한 것 으로 보고되어 있다.
본 가설의 주안점은 위의 가설들에서와 마찬가지로
스트레스시 일어나는 아연의 방출과 세포 내 유입이 HSP 유발의 필요조건이다 라는 것이다. 이 가설의 검증을 위한 첫 단계로는 세포배양체에서 아연이 HSP의 mRNA와 단백질을 유발하는 지를 검증한다. 다음 동물 모델에서 경련이나 허혈을 일으킨 후 HSP가 유발되는지 보고, 이 과정에 아연의 방출 유입이 관계되는지 TSQ staining과 zinc chelator 등을 이용하여 검증한다. 그 다음 HSP가 유발되는 신경세포들이 죽어가는 것인지 아니면 다음에 오는 동종의 스트레스에 대해 보호 작용을 하는 지를, 연속적인 스트레스 (경련, 허혈)를 줌으로써 검증한다.
 

세부 가설 II-2
경련, 전뇌 허혈, 국소 허혈 주변 (penumbra)에서 보이는 선택적 신경세포사를 매개한다.

선택적 신경세포사란 손상을 받은 뇌에서, 특정한 신경세포들만이 죽는 경우를 일컫는다. 예를 들어, 일시적인 전뇌허혈에서는 해마에서 hilus 와 CA1, 대뇌 피질의 layer 2, 3, 5, 그리고 striatum, amygdala, thalamus 등의 일부 신경세포들에서 선택적 신경세포사를 볼 수 있다 (Smith et al., 1984). 이와 비슷한 현상이 국소 허혈 시에 생기는 infarct core 주위에서 보 이는데, 이러한 부위를 penumbra (Olsen, 1986) 라고 한다.
본인은 이러한 선택적 신경세포사의 분포를 설명하는 데 시냅스 아연에 의한 신경세포사가 적합한 틀을 제공해준다고 생각하고 있다. 실제로 최근 본 저자 등은 전뇌 허혈시 선택적 신경세포사에서 아연의 전이를 관찰하였고, 더욱이 아연 chelator를 사용 하여 이러한 신경세포사를 방지할 수 있었다 (Koh et al., 1996). 또한 kainate seizure의 경우에도 이와 비슷한 결과를 얻었 다 (Suh and Koh, unpublished). 따라서 이 두 경우 선택적 신경세포사에 시냅스 아연의 전이가 큰 기여를 할 것이라는 것은 거 의 확실하다.
본 연구에서는 지금까지의 연구를 더욱 발전 시켜, 전뇌허혈 시와 kainate seizure 시의 아연의 전이가 어떤 시간과정을 거쳐 일어나며, 어느 정도의 아연 방출 유입이 신경세포사를 일으키는 지를, 아연을 측정하는 probe들을 사용하여 측정할 예정이다. 이러한 정보는 허혈시 아연에 의한 신경세포사를 방지하는 방법을 고안하는 데 도움이 될 것이다. 이에 덧붙여, 국소 허혈 시 penumbra 와 뇌 외상 시에 보이는 선택적 신경세포사에서 아연의 역할을 같은 방법을 이용하여 검증할 예정이다.
 

세부 가설 II-3
Reactive oxygen species (ROS) 생성을 증가시키고, CaM kinase II의 활성도 저하를 야기하여 신경세포의 necrosis를 일으킨다.

여러 연구 결과들이 일과성 전뇌허혈 후 재관류 시 ROS 의 생성이 증가되고, 이러한 결과로 신경세포사가 확산된다는 가능성 을 시사하였다 (Floyd and Carney, 1992; Shivakumar et al, 1995). 본 저자는 이러한 ROS 의 증가가 시냅스 아연의 과다 유입 에 의해 유발된다는 가설을 제시한다. 아연은 Fenton 반응에 관여하지 않고 따라서 oxidative injury를 일으키지 않는 다는 것이 정설이었으나 (Chevion, 1989), 일부 연구 결과들에 따르면, 아연 자체가 세포 내에서의 oxygen free radical의 생성을 유발할 수 있다는 것이 알려져 있다 (Splittgerber and Tappel, 1979). 또한 본 연구팀의 예비 연구 결과에서도, 아연에 의한 신경세포 사가 antioxidant 인 trolox 에 의해 상당히 완화되는 것이 관찰되었다 (Kim and Koh, unpublished).
아연에 의한 free radical 생성의 기전이 무엇인지는 알려져 있지 않다. 한 가능성으로는, 아연이 PKC의 강력한 활성제이고 P KC는 free radical의 생성을 증가시키므로 (von Ruecker et al., 1989; Hammer et al, 1993), 이 경로를 통하여 아연이 free rad ical 생성을 증가시킬 가능성이 있는 것으로 사료된다. 이 밖에 free radical 생성과 대사에 관여하는 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase, glutathione 등에 아연이 직접적으로 영향을 줄 가능성도 있다. 또한 아연이 free radical 생 성의 주 부위인 mitochondria 의 기능과 구조에 변화를 초래할 가능성도 있을 것이다. 이러한 가능성들을, PKC inhibitor, enzym e assays, glutathione assays, oxidation-sensitive fluorescent dye, EM, ATP level, mitochondrial enzyme inhibitor 들을 이 용하여 연구한다. 이러한 실험들에 의해 아연이 free radical generation 에 미치는 영향을 종합적으로 규명할 수 있을 것으로 기대된다.
전뇌허혈 시 일어나는 다른 한 가지의 흥미로운 변화는 CaM kinase II 활성도의 급격한 저하이다 (Churn et al., 1990). 이 의 원인에 대해서는 아직 알려진 것이 없으나 시냅스 아연의 전이가 그 원인일 가능성이 있다. 아연은 CaM kinase II의 활성도 에 복잡한 효과를 나타낸다. 수 십 M 농도에서는 CaM kinase II 활성도를 저하시키지만, mM 농도에서는 CaM kinase II를 calcium-independent한, 활성화된 형태로 변화시킨다 (Weinberger and Rostas, 1991). 실제로 아연의 유입이 CaM kinase II 활성도 저 하의 원인인지를 규명하기 위해, 1) 아연의 유입을 배양신경세포에서 일으켜, CaM kinase II 활성도에 변화가 일어나는지 보고, 2) 아연 chelator를 사용하여 전뇌 허혈 후 일어나는 CaM kinase II 활성도 저하가 방지되는 지를 본다.
 

세부 가설 III-1
시냅스 아연이 베타 아밀로이드의 응집을 유도하고, 아연을 chelation 함으로써 이러한 현상을 방지한다.

최근 수년간 분자 생물학의 발전에 힘입어, 노인성 치매 (Alzheimer's disease; AD)의 병인에 대한 지식이 급속히 증가하 고 있다. 종합해보면, 노인성 치매의 병인에 가장 직접적인 요인은 21번 유전자에 위치한 amyloid precursor protein (APP) 으로부터 만들어지는 amyloid 또는 A protein (39-42 amino acids)의 축적이라는 것이 점차 확실해져 가고 있다. 이와 연ㄱ 되어, 어떻게 해서 amyloid 축적이 노인성 치매에서 일어나는 신경세포 퇴행과 사멸을 유도하는 지에 대해서도 현재 활발한 연구가 진행중이다. Pike 등은 amyloid의 신경세포독성은 응집된 상태에서만 나타난다는 것을 밝혔다 (Pike et al., 1993). 따라서 amyloid의 응집 과정이 어떻게 일어나는 가가 연구의 관심이 되었는데, 최근 Tanzi group 등에 의해 아연을 비롯한 중 금속들이 amyloid의 응집 과정을 촉매 한다는 것이 밝혀졌다 (Bush et al., 1994). 따라서 시냅스 아연의 방출이 이 과정에 관여할 개연성이 존재한다고 하겠다.
이를 직접적으로 증명하기 위해서는 soluble form 의 amyloid를 stereotaxic 장치를 이용하여 쥐의 해마에 투입, 전기적 자극을 가하여 아연의 방출을 유도한 후 amyloid의 응집이 동물에서 일어나는지 살펴보고, 이러한 현상이 실제로 일어나면, 아연 chelator에 의해 amyloid의 응집이 방지가 되는지 관찰할 예정이다. 또 APP transgenic mice에 아연 chelator를 주어 plaque 형성이 덜 일어나는 지 본다.
 

세부 가설 III-2
시냅스 아연의 장기간에 걸친 신경세포 내로의 유입이 AD에서의 neurofibrillary degeneration (tangle formation) 의 주기전 이다.

AD 에서 amyloid의 축적과 함께 항상 나타나는 병리 현상이 신경세포 안에 비정상적으로 인산화가 일어난 tau가 축적되 는 neurofibrillary tangle의 형성이다. 이러한 현상이 어떤 기전으로 일어나는 지는 아직 알려져 있지 않으나, free radical injury 나 phosphatase 활성도의 저하 등이 그 후보 기전으로 논의되고 있다.
아연을 포함한 중금속들이 cytoskeletal protein의 기능에 장애를 일으키고 이 들의 응집 현상을 유발하므로, tangle formati on에도 시냅스 아연이 기여할 가능성이 있어 보이나, 아직 체계적인 연구는 되어 있지 못하다. 아연의 역할을 시사하는 다른 소 견으로는 tangle이 많은 부위가 정확하게 시냅스 아연의 분포도와 일치한다는 것이다. 따라서, 아연이 tangle formation을 일으 킬 가능성은 필히 검증되어야 할 가설로 여겨진다.
이를 위해 culture에서 아연에 의한 신경세포 퇴행시 tangle이 형성되는 지를 보고, in vivo에서 아연의 단독 주입 또는 amyloid와 아연의 공동 주입 시에 tangle formation이 일어나는 지 등을 알아보는 실험을 수행할 예정이다.

 

 

Summary I Aims I Methods

 . 연구의 최종목표

- 시냅스 아연의 병리적인 역할과 시냅스 신호 전달과 연관된 생리적 기능들을 분자적 수준에서 규명
- 이를 응용하여 신경계 질환의 예방과 치료제 개발 달성
 

. 연구목표 및 내용

시냅스 아연이 1) 여러 급성 뇌 질환에서의 신경세포사에 기여하는 지 여부와 정도, 그리고 그 분자적 기전과, 2) LTP 등 의 synaptic plasticity 과정에의 기여 여부와 그 기전 규명, 그리고 3) 노인성 치매의 병리 현상에의 기여 여부 규명.
 

 연구 목표 (구체적):
가설 I-1에서 가장 중요한 단계가 해마에서의 LTP에 시냅스 아연이 관여하는 지 여부이다. LTP를 형성하는 고빈도 자 극시 아연의 전이가 일어나는 지를 보고, zinc chelator가 LTP 형성에 어떤 변화를 가져오는 지를 관찰한다.
이와 병행하여
가설 I-2 의 검증이 1차 계획 연도에 시도될 것이다. 우선 뇌에서 immediate early gene (IEG)이 발현 되는 조건들을 찾고, 이 과정에 시냅스 아연의 전이가 관여하는 지를 zinc chelator 를 사용하여 검증한다. 또한 이러한 IEG 의 발현과 neuronal cell death 간의 상관 관계를 알아낸다. 가설 I-3 가설 I-2 와 밀접하게 연관되어 있을 가 능성이 크다. 따라서, 동일한 실험 방법을 이용하여, 시냅스 아연이 neurotrophin gene을 조절하는 지를 살핀다.
가설 II-1은 경련이나 허혈에서의 HSP 유발 기전에 대한 가설이다. 위에 언급한 방법들을 이용하여 아연의 HSP유발에 서의 역할을 규명한다.
가설 II-2는 본 연구의 두 중심축 중의 하나이다. 이미 일과성 전뇌 허혈에서 시냅스 아연의 전이가 선택적 신경세포 사의 주 기전이라는 것이 밝혀졌고 다음 단계로 같은 model에서, 아연 전이의 시간 과정, 아연 유입 후 일어나는 신경세포의 변화, 그리고 아연에 의한 신경세포사를 효과적으로 방지할 수 있는 방법 등을 알아낸다.
가설 II-3 가설 II-2 의 근저를 이루는 의문점 중의 하나에 대한 종속 가설이다. 우선 아연에 의한 신경세 포사가 necrosis 인지 apoptosis 인지 밝혀낸다. 그 다음 아연의 유입이 구체적으로 어떤 과정을 활성화 또는 저하 시켜, 신경 세포사를 일으키는 가를 알아낸다. 우선 다음 두 가설을 검증한다. 1) 아연의 유입이 free radical 생성을 항진시켜, oxida tive stress에 의한 세포사를 일으킨다. 2) CaM kinase II 의 활성도를 저하시켜 세포사를 일으킨다. 1) 의 검증을 위해 세 포배양체에서 아연의 신경 독성이 antioxidant 에 의해 완화되는 지를 보고 어떤 과정에 관여하는 지를 검증한다. 2)이를 검증을 위해, 아연의 세포내 유입이 calmodulin과 CaM kinase II 활성도에 어떤 영향을 주는 지 규명하고, inhibitor들이 아연에 의한 신경세포사에 어떤 영향을 주는 지 규명한다.
가설 III-1은 아연의 세포 외로의 방출이 베타 아밀로이드의 응집을 유도한다는 것이다. 이의 동물에서의 검증을 위하 여 soluble beta amyloid를 흰쥐의 해마 또는 amygdala 등에 주입하고, 전기적 방법으로 경련을 일으켜, amyloid 의 응집이 더 많이 일어나는 지를 관찰한다. 그 다음, zinc chelator를 투여하여 이러한 응집과정이 방지되는 지를 본다. 이 후 APP transg enic mice를 얻어 zinc chelator들이 amyloid 축적과 응집을 완화시키는 지 본다.
마지막 (
가설 III-2)으로 노인성 치매에서 보이는 neurofibrillary tangle 형성에 아연의 유입 또는 대사 이상이 관여 한다는 가설을 검증한다. 우선 신경세포 배양체에서 아연의 유입 후에 일어나는 cytoskeletal protein들의 변화를 측정하고, Al z-50 같은 tangle 에 특이 반응을 하는 항체들을 이용하여 면역화학법으로 신경세포내의 tangle formation 여부를 관찰한다.

 

 

Summary I Aims I Methods

1) 신경 세포배양체를 이용한 연구

(1) 대뇌 피질 신경세포 배양
        신경세포의 배양을 위해서 mouse 태아의 neocortices을 분리하여 조직을 단일 세포로 나눈 후 세포를 분주해서 CO2 배양기에 넣는다. 3-5 일째에 glia 의 번식을 억제하기 위해 Ara-C 로 처리한 후, DIV 7-10 이후에 실험을 한다.

(2) 배양체에서의 신경세포사
        독성 실험에는 serum을 뺀 culture medium을 이용한다. 세포들은 현미경으로 계속 관찰하며, 세포사는 죽은 세포로부터 배지로 유리된 LDH 활성을 측정하여 정량화한다 (Koh and Choi, 1987).

(3) 면역 염색법 (Immunocytochemistry)
        배양신경세포를 4 % paraformaldehyde로 고정시킨 다음, serum으로 30 분간   blocking 시키고, primary antibody와 1 시간 이상 반응시킨다. 잘 씻어준 후, secondary antibody와 반응시킨다. 이후, 미리 만들어 놓 은 avidin-biotin mixture 에 30분간 반응시킨 다음, diaminobenzidine 용액에서 약 10 분 정도 발색시킨다.

(4) Western blot
        세포배양체로부터 particulate fraction을 50 mM Tris buffer 용액에 만든다. 단백질을 7.5 % SDS polyacrylamide gel 에 전 개시킨 후, Immobilon-P membrane 에 transfer 하고, antibodies와 하루 incubate 시킨다. Blot은 세척 후 peroxidase-linked secondary antibody에 상온에서 2 시간 반응시킨 후 4-chloro-1-naphthol을 이용하여 band를 검색한다.

(5) In situ hybridization
        S
35-gamma-ATP를 이용하여 보고자 하는 mRNA에 complementary한 radioactive oligonucleotide probe 를 만든다. 뇌조직이나 배양체를 이 OND로 일정시간 처리하고 감광시켜 조직과 세포안에서의 mRNA level을 본다.
 

2) Tissue slice 에서의 연구

(1) Synaptic potentials and LTP in hippocampal slices
        해마의 절편을 vibratome 으로 얻은 후 oxygenated chamber에서 1 시간 stabilize 시킨다. 이후 half-submerged preparation 을 이용하여 CA1 또는 CA3 에서의 자극 후 EPSP, field potential 등을 standard method를 이용하여 측정한다.

(2) Zinc efflux and influx studies in slices
        Hippocampal slice 와 in vivo에서 LTP, injury 상태 등에서의 아연의 방출 유무, 그 정도 등을 TSQ 방법 등을 이용하여 측정 한다.

(3) Interventional studies
        LTP를 일으키는 조건에서 Zn chelator들을 투여하여 LTP에 영향을 주는 지 본다.

(4) Other synaptic plasticity models
        Cortical slice 에서의 LTP 등을 위에 언급한 방법들을 이용하여 연구한다.
 

3) In vivo 연구

(1) 일과성 전뇌 허혈 (Transient global cerebral ischemia)
        성체 쥐를 마취후, 양 경동맥을 결찰하고 저혈압을 동시에 일으킴으로써, 일과성 전뇌 허혈을 유발한다 (Smith et al., 1984 ).

(2) 뇌국소 허혈 (Focal ischemia)
        중뇌 동맥 공급 부위의 허혈을 쥐의 경동맥을 통하여 suture material 을 일정시간 삽입함으로써 유도한다. 재관류는 suture를 다시 제거하여 일으킨다.

(3) Kainate에 의한 경련성 신경세포 손상 (kainate seizures)
        성체 쥐에 kainate를 복강 주사하여, seizure를 유도하고, 일정 시간후 뇌 절편을 위에 언급한 여러 가지 방법으로 염색하여 비교 분석한다.

(4) Gene expression
        여러 가지 뇌 손상 model에서 immediate early gene 이나 HSP expression 을 in situ hybridization, immunocytochemistry, Western blot 등을 사용하여 살펴본다.

(5) 베타 아밀로이드의 응집
        Soluble 베타 아밀로이드를 쥐의 뇌안에 주입하고, 아밀로이드의 응집과정을 시간별로 관찰한다. 그 다음, 쥐에 electrical stimulation을 주어 아연의 방출을 유도한 후 응집 과정에 어떤 영향을 주는지 관찰하며, 아연 chelator들이 이 응집을 더디게 하는 지 알아본다. APP transgenic mice를 이용하여 plaque 형성에 미치는 아연의 역할을 규명한다.

(6) Neurofribrillary tangles
        Neurofibrillary tangle 은 silver staining으로 동정한다. Cell culture 에서, 아연을 준 후 tangle이 생기는 지를 본다. 다른 세포골격단백의 변화도 검증한다.
 

4) Others

(1) Protein kinase C (PKC) assay
        세포를 냉동시킨 후 phosphatase와 protease inhibitor를 포함하는 용액에서 분쇄한다. 500 g에서 원심 분리후, 상층액을 다 시 50,000 g에서 20 분간 원심 분리한 후, 고형물을 용해 buffer 에 녹인다. p
32-ATP를 이용하여 substrate의 인산 화정도를 측정한다.

(2) CaM kinase II assay
        Homogenate를 단백정량후, 칼슘의존성 인산화를 측정한다. 반응은 칼슘을 가함으로써 시작되고, 1 분후 SDS 용액을 가함으로 써 중단된다. SDS-PAGE gel electrophoresis 후 Coomassie blue 로 염색하고, X-ray film에 감광시킨다. 활성도는 50 과 60 k D kinase subunit와 synapsin-I 의 인산화를 측정함으로써 정량한다.
 
 

연구결과의 과학기술 및 사회경제적 가치

1) 과학 기술적 가치

        본 연구는 시냅스 아연의 여러 가지 생리적, 병리적 작용들을 종합적으로 규명하려는 세계 최초의 시도이다. 문헌을 검색 하여 보면, 시냅스 아연의 작용에 대한 논문들의 수가 칼슘이나 글루타메이트 등의 작용에 대한 그 것보다 훨씬 적다는 것을 쉽 게 알 수 있다. 이러한 차이의 근본 이유는 시냅스 아연이 과학적 중요도에서 칼슘이나 글루타메이트에 뒤떨어져서가 아니고, 이 아이디어 자체가 주장된지 얼마 안되고 (Koh and Choi, 1994; Koh et al., 1996), 또 기존의 paradigm을 무너뜨리는 혁신성을 지니고 있어, 아직 많은 신경과학자들이 관망하는 상태이기 때문이라고 생각된다. 하지만, 지금까지의 증거들만을 보더라도 시냅 스 아연이 여러 경우의 신경세포의 사멸과 신경간 신호 전달 체계에 중요한 역할을 할 가능성이 아주 크다. 특히 본 저자 등이 일과성 전뇌 허혈 후와 간질 발작 이후에 시냅스 아연의 전이가 일어나고, 이러한 현상을 방지하므로써 신경세포사를 상당히 완 화시켜 주는 것을 보고한대로 (Koh et al., 1996; Suh et al., 1996), 아연의 신경세포사에서의 역할은 거의 확실하다. 하지만 시냅스 아연의 생리적 역할이 무엇인지에 대해서는 아직 모르는 것이 대부분이다.
하지만 여러 증거들로 미루어 시냅스 아연에 관한 신경 생물학은 앞으로 60-70년대의 칼슘, 80년대의 글루타메이트의 신경 생 리와 신경 독성, 그리고 90년대의 apoptosis 분야와 비슷하게 거대한 연구 분야로 발전할 가능성이 크다. 좀 더 구체적으로 살 펴보면, 시냅스 아연의 독성에 관한 연구들은 신경 세포사의 기전을 이해하는 데 중요한 정보를 제공할 것이고, 이에 따라 여러 가지의 새로운 연구 과제들의 창출을 가능하게 해 줄 것이다. 또한 노인성 치매 연구에 있어서도 의문점으로 남아있던 베타 아 밀로이드 축적 기전과 neurofibrillary tangle 형성을 연결시켜 줄 수 있는 새로운 파라다임이 가능할 것으로 기대된다. 가장 중요한 것은 시냅스 아연의 정상 역할을 이해하는 것이다. 이에 수반될 수 있는 연구 영역의 확대는 현재 문헌상의 칼슘 연구의 양을 생각해보면 어느 정도 추정 가능하리라 생각된다. 금속에 의한 시냅스를 가로지르는 신호 전달 (
orthograde trans-syna ptic signal transduction)이라는 개념은 신경과학사적 관점에서 아주 중요한 paradigm shift라고 생각할 수 있을 것 이다.
이러한 예상들을 종합하건대, 시냅스 아연의 작용들에 대한 연구는 현재 주목받고 있는 여러 가지 신경 과학 연구의 파라다임 들과 비교하여 그 잠재적 중요성에 있어 조금도 손색이 없는 분야라고 생각되고, 지금 이에 대한 기반 연구는 앞으로 이 분야에 서 우리의 연구 수준을 세계의 선두로 유지하는 데 필수적이라고 생각된다.
 

2) 사회 경제적 가치

        이 연구에서 얻은 정보와 지식들은 사회 경제적으로 아주 다양한 실제 효용 가치를 가질 것으로 예측한다. 우선, 아연에 의한 신경 독성이 어떤 기전으로 일어나는 지를 알아낼 것이고, 이에 수반하여 여러 종류의 신경질환 치료제 (신경세포 보호제) 개발이 가능해 질 것이다. 더불어 노인성 치매에서 베타 아밀로이드의 축적, 응집과 neurofibrillary tangle의 형성을 완화 또 는 늦추어 줄 수 있는 방법들을 고안할 수 있을 것이다. 또한 아연이 정상적인 신경간 신호 전달에 어떤 영향을 미치는 지에 대 한 종합적인 이해가 가능해 질 것이고, 이에 따라 LTP 같은 기억 작용과 관계된 여러 근본적인 현상들을 좀 더 잘 이해 할 수 있 게 될 것이다. 이러한 지식들은 기초 신경 생물학의 근간이 될 수 있을 뿐 더러, 치매와 같은 기억 손실 질환들의 기억 능력 증 진에도 응용될 수 있을 것이다. 나아가, 신경 세포들에서 여러 종류의 신호전달과 관계된 gene expression에 아연이 어떤 역할 을 하는 지를 알아내고, 이에 따라 이러한 현상을 신경 생물학적으로 좀 더 잘 이해할 수 있는 틀이 마련될 것이다.
잘 알다시피 현재 우리 사회는 서구와 마찬가지로 노령화의 길을 가고 있고 이에 따라 여러 가지의 퇴행성 신경 질환 환자의 수와 그에 따른 사회 경제적 부담이 빠른 속도로 증가 되고 있다. 그 대표적인 질환들이 위에 언급한 노인성 치매, 뇌졸중 등이 다. 따라서 이러한 환자들을 대상으로 하는 유효 약물의 개발은 엄청난 경제적 실익을 유발할 수 있을 뿐 더러, 환자와 그 가족 의 고통을 덜어주는 데 이바지 할 수 있을 것이다. 나아가, 신물질의 특허를 미국과 유럽까지 연장한다면, 환자의 수를 고려하건대, 천문학적인 경제적 효과를 기대할 수도 있을 것이다.

 

Summary I Aims I Methods